Báo cáo Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của đăk lăk

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ LÊ XUÂN CƯỜNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM NỘI SINH TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA ĐĂK LĂK (Báo cáo tóm tắt luận văn tốt nghiệp thạc sỹ) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng BUÔN MA THUỘT, NĂM 2013 1. Tính cấp thiết của Phân bón vi sinh ra đời 1896 tại Đức. Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học. Ở Việt Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm 1960. Tình hình sản xuất phân vi sinh trong nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nhiệp. Do đó việc nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết… Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7]. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài của vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk Lăk. “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”. - Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk. - Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô. 1. Tính cấp thiết của Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. 2. Mục tiêu của đề tài 3. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học - Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, sống nội sinh trong rễ cây ngô. 2.1 Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: 1. Phân lập, mô tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh học phân tử một số chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây ngô. 2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô. 3. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn. 2.2.2.Phương pháp phân lập. Mẫu được thu thập một cách ngâu nhiên trên các nền đất khác nhau Toàn bộ bộ mẫu rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng và ghi nhãn: + Nơi lấy + Ngày lấy + Người thu mẫu. 2.2.1.Phương pháp thu mẫu. Vòng pellicle Dòng thuần trên môi trường Nfb+cao nấm men+ amoniClorua Sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh vi hiếu khí Khuẩn lạc trên Nfb vô đạm 2.2.Phương pháp nghiên cứu. Quá trình phân lập và làm thuần giống được thực hiện trên Nfb vô đạm. 2.2.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh. Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994. 2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây ngô. Xây dựng phương trình đường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA. 2.2.5 Phương pháp xác định khả năng cố định N của các chủng VK * Phương pháp thí nghiệm: Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm các chủng vi khuẩn cố định đạm phân lập được. Lưu ý: Mỗi chủng vi khuẩn 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 10 bầu đất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, sinh khối khô. 2.2.5.1. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục + Hàm lượng diệp lục và carotenoid được xác định bằng phương pháp so màu [36]. + Xác định hàm lượng đạm tổng số trong lá bằng phương pháp Kjeldah + Xác định hàm lượng phosphat tổng số trong lá bằng phương pháp quang phổ. 2.2.6.Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh bằng phương pháp PCR xác định gen nifH. Mồi đặc hiệu cho gen nifH cũng như quy trình cho phản ứng PCR được cung cấp và thực hiện tại VCNSH &MT, trường Đại học Tây Nguyên. Môi xuôi (Pol F) (5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3') Mồi ngược (Pol R) (5' - ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3') Sản phẩm sau phản ứng được điện di có kích thước 360bp ghi nhận thông qua thang chuẩn 100bp để kết luận: Nếu xuất hiện vạch có kích thước 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập có mang gen nifH, ngược lại. 2.2.7 Phương pháp định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Gửi mẫu định danh tại Công ty TNHH Nam Khoa – TP. HCM để giải trình tự gen 16S xác định tên loài. 2.2.8. Phương pháp nghiên cứu nhân nuôi sinh khối của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn Tối ưu môi trường nuôi cấy. Nfb, BMS, Fallik. Tối ưu thời gian nuôi cấy 24h, 48h, 72h, 96h. Tối ưu nhu cầu Oxy 0 rpm, 100 rpm, 150 rpm, 200 rpm, 250 rpm. Tối ưu pH môi trường nuôi cấy. pH = 4,8 ; pH = 5,8; pH = 6,3; pH = 6,8 ; pH = 7,8. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy 270C, 320C, 370C, 420C 3.1 Kết quả phân lập một số chủng VK cố định N trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk. Sự hiện diện của VK nội sinh vi hiếu khí Cấy truyền tạo dòng thuần Các dòng thuần Phân lập được 31 dòng vi khuẩn kí hiệu từ C1 đến C31). Trong đó có 9 dòng ở Krông Năng C1 đến C9. 10 dòng ở dòng ở thành phố Buôn Ma Thuột C10 đến C19. 12 dòng ở huyện Ea Súp C20 đến C31. Vòng pellice 3.2. Kết quả mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm Hinh 1: Hình thái một số chủng vi khuẩn trên môi trường vô đạm Nfb C11 C23 C14 - Trắng sữa C31 - Vàng nhạt C23 - Trắng sáng C23 – Gram (-) 3.3.Kết quả nghiên cứu xác định khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn cố định đạm 31 chủng phân lập được đều có khả năng sinh IAA. Cao nhất C14 13,51mg/l. Thấp nhất C28: 1,77mg/l Biểu đồ A: Khả năng sản sinh IAA của các chủng vi khuẩn 3.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất.(BẢNG 3.5) Số lượng lá tăng từ 26,7 - 33,3%. Chiều dài lá tăng từ 9 – 38,5%. Chiều cao cây tăng từ 7,4 - 44%. Đường kính gốc thân tăng 10,9 – 33%. ĐC C23 Đo các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất Chiều dài rễ tăng 4,5 – 26%; Khối lượng rễ 7,0 – 29,2%; Sinh khối tươi 12,5 -53,5%; Sinh khối khô 9,8 – 58,8% so với ĐC. Biểu đồ A: Tác động của VK cố định N đến sinh khối tươi của cây ngô. Biểu đồ B: Tác động của VK cố định N đến sinh khối khô của cây ngô. Kết quả khi xử lý số liệu và biểu đồ cho thấy có 29/31 NT khi nhiễm các chủng VK cố định đạm làm cho tích lũy diệp lục tổng số có trong mẫu lá tăng 1,2 - 2,6 lần (tức tăng 11-84%) so với ĐC. Tuy nhiên C7, C30 có tích lũy diệp lục tổng số cao hơn nhưng khác biết không có ý nghĩa thông kê ở mức ý nghĩa 0,01. 3.5. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng diệp lục trong lá Biểu đồ: Tác động của VK cố định N đến hàm lượng cholrophyll tổng số tích luỹ trong lá CV= 2,39 ; alpha=0,01 3.6. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm đến hàm lượng N và phosphat tổng số của cây ngô. Tích luỹ N tổng số trong lá tăng 1,2 - 2,4 lần (tức tăng từ 5 - 45%) và tăng tích lũy P tổng số 1,1 -1,8 lần (22-38,9%) so với ĐC. C1 tích lũy N thấp hơn so với ĐC. Biểu đồ C: Tác động của VK cố định đạm đến hàm lượng N tổng số Biểu đồ D: Tác động của VK cố định đạm đến hàm lượng P tổng số Sau khi phân tích các chi tiêu theo dõi chúng tôi tuyển chọn được 13 chủng có phản ứng tốt khi cộng sinh với hệ rễ cây ngô, đó là các chủng: C31, C14, C23, C30, C11, C29, C10, C16, , C13, C8, C21, C6, C18. 3.7. Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm bằng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh mang gen nifH. 500bp 360bp Kết quả điện di sản phẩm PCR có 9/13 chủng tuyển chọn có vị trí đặc hiệu với band DNA ở vị trí 360bp. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có mang gen nifH mã hóa cho việc cố định N. Các chủng dương tính với nifH bao gồm: C6, C10, C13, C14, C18, C23, C29, C30, C31. Các chủng còn lại có band DNA không trùng với vị trí 360bp nên (-) với gen nifH. 360bp Ghi chú: M Thang chuẩn 100bp (-) Chứng âm Cn Giếng chứa DNA VK Kết quả điện di các chủng vi khuẩn cố định N nội sinh với cặp mồi chuyên biệt cho gen nifH Như vậy qua quá trình sàng lọc chúng tôi tuyển chọn 3 chủng (C31, C14, C23) có hoạt tính cố định N cao để giải trình tự gen 16S xác định tên loài và nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nuôi của 3 chủng này. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Pseudomonas nitroreducens Theo nghiên cứu của Ngô Thanh Phong và cộng sự trường đại học Cần thơ khi phối hợp giữa 2 chủng Pseudomonas sp KG1 và Pseudomonas sp KG2 thay thế (50-75% N) Khi giải trình tự 16s thì chủng Pseudomonas sp.BT2 này có mức tương đồng 99% với chủng P.nitroreducens [22]. Đây cũng là cơ sơ khoa học quan trọng để để chúng tôi khẳng định sự cố định đạm của P. nitoreducens khi sống nội sinh trong hệ rễ của cây ngô. Và trên thực tế khảo nghiệm các cây ngô trong bầu đất có nhiễm chủng P. nitroreducens tích lũy N tổng số trong lá luôn cao hơn so với đối chứng 1,8 lần. 3.9. Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Pseudomonas nitroreducens C14 C14: Pseudomonas nitroreducens Burkholderia sp KG2/Bur vô đạm (Nguyển Thị Minh Thư, 2010, ĐH Cần Thơ) B.Cenocepacia C23/ Nfb vô đạm 3.9. Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Chủng C23: Burkholderia cenocepacia (bắp và mía của Reis, 2004) PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.9. Kết quả định danh 16s các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. C31: Pseudomonas entomophila Theo nghiên cứu (Dobereiner, 1992) thì Pseudomonas trong hệ rễ cây lúa làm tăng N tổng 20 – 25%. So với kết quả của chúng tôi khi nhiễm P. entomophila trong hệ rễ cây ngô làm cho tích lũy N tổng trong lá luôn cao hơn gấp 2 lần so với ĐC, tăng 39% so với ĐC và cao hơn so với kết quả nghiên cứu (Dobereiner) từ 14 - 19%. P.entomophila/ Nfb vô đạm PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.10. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của chủng đã tuyển chọn 3.8.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng đã tuyển chọn. BMS=(1,3-1,6)Fallik =(5-9)Nfb vô đạm BMS là môi trường thuận lợi nhất cho sự tăng sinh của cả 3 chủng. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.8.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn. Thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas nitroreducens và Burkholderia là sau 48h nuôi cấy Thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas entomophila là sau 48h- 72h nuôi cấy. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.8.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng vi khuẩn. Tốc độ lắc tối ưu cho chủng Pseudomonas entomophila và Burkholderia là 150rpm/phút. Tốc độ lắc tối ưu cho chủng Pseudomonas nitroreducens là 150 -200rpm/phút. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.8.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn. pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Burkholderia là cenocpacia 6,3; Pseudomonas nitroreducens là 6,8; Pseudomonas entomophila 7,8. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.8.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của Pseudomonas nitroreducens và Pseudomonas entomophila là 320C, Burkholderia cenocepacia là 370C. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN 1. Đã phân lập và mô tả đặc điểm hình thái của 31 chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên môi trường vô đạm Nfb. Cả 31 chủng đều có khả năng sinh IAA. 2. Tuyển chọn được 9 chủng có phản ứng tốt với sự sinh trưởng, tích luỹ chlorophyll, N, P…và dương tính với gen nifH (C6, C10, C13, C14, C18, C23, C29, C30, C31). Trong số đó đã giải trình tự gen 16S được 3 chủng C14, C23, C31 là những chủng cho hoạt tính cố định đạm, khả năng sinh IAA cao là các chủng Pseudomonas nitroreducens C14, Burkholderia cenocepacia C23, Pseudomonas entomophila C31. Khi nhiễm các chủng này vào hệ rễ cây làm tăng số lá 23 – 33%; chiều dài lá; 18,8 – 38,5%, chiều cao cây 29,5 – 44,2%; đường kính gốc thân 24,3 – 31,5%; chiều dài rễ 24,2 – 25,9%; khối lượng rễ 21,9– 27%; sinh khối tươi 41,8 - 53,5%, sinh khối khô 48,8 – 58,8% ; tích luỹ diệp lục tổng số tăng 69,4 -84,9%; tích lũy N trong lá tăng 35,4 – 54,2%; tích luỹ P tăng 30,5 – 36% so với ĐC. 3. Đã xây dựng được quy trình nuôi cấy của 3 chủng với các thông số sau: Pseudomonas nitroreducens C14: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau 48h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 -200 vòng/ phút ở pH 6,8 và nhiệt độ 320C. Pseudomonas entomophila C31: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau 48h -72h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/ phút ở pH 7,8 và nhiệt độ 320C Burkholderia cenocepacia C23: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau 48h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở pH 6,3và nhiệt độ 370C. KẾT LUẬN 1. Tiếp tục nghiên cứu định danh các vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk lăk có hoạt tính cố định đạm cao, có phản ứng tốt đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô. 2. Nghiên cứu về những đặc tính có lợi khác của chủng Pseudomonas entomophila, Pseudomonas nitroreducens B. cenocepacia tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk Lăk nói nói riêng và khu vực Tây Nguyên nói chung làm cơ sở sản xuất các loại phân bón chuyên dụng cho cây ngô. KIẾN NGHỊ